愈心痛对犬急性缺血心肌 ECE、NOS 基因表达的影响及铜锌-SOD 免疫组织化学研究

摘要

目的：探讨益气活血复方愈心痛胶囊对缺血心肌组织内皮素转换酶 (ECE)、一氧化氮合酶 (NOS) 基因表达和铜锌超氧化物歧化酶 (铜锌-SOD) 免疫组织化学反应的影响，阐明愈心痛胶囊抗心肌缺血的作用机制。

方法：采用结扎麻醉犬冠状动脉左前降支中段的方式，造成实验性犬急性心肌缺血病理模型，以原位杂交技术检测缺血心肌中 ECE 和 NOS mRNA 的表达，用免疫组织化学方法观察缺血心肌中铜锌-SOD 阳性反应程度。

结果：在缺血心肌组织中，ECE mRNA 呈高表达，NOS mRNA 呈低表达，愈心痛可提高缺血心肌中 NOS mRNA 表达水平，削弱 ECE mRNA 的异常表达，从而保护缺血心肌；同时，缺血心肌中铜锌-SOD 免疫反应减弱，而愈心痛可显著增强缺血心肌组织中铜锌-SOD 阳性反应程度，提高 SOD 活性。

结论：愈心痛胶囊的上述抗心肌缺血的作用，部分说明了益气活血方药的作用机理，提示该方可能对缺血性心脏病的治疗具有潜在的临床应用价值。

关键词

愈心痛胶囊；心肌缺血；内皮素转换酶；一氧化氮合酶；原位杂交；免疫组织化学

研究背景

内皮素转换酶（ECE）和一氧化氮合酶（NOS）是调节血管舒缩功能的关键酶，超氧化物歧化酶（SOD）是重要的抗氧化酶。三者在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用。本实验采用组织原位杂交技术检测了 ECE 和 NOS 基因在缺血心肌的表达水平及分布，并对缺血心肌进行了铜锌-SOD 免疫组化染色和图像分析，以探讨 ECE、NOS 和氧自由基在心肌缺血发病机制中的作用以及益气活血复方愈心痛胶囊对其影响。

材料和方法

1. 动物分组与标本制备

选用健康成年犬 20 只，雌雄不限，体重 (18.85±1.96)kg，由中国中医研究院西苑医院动物室提供，随机分为：空白对照组 5 只，生理盐水 3ml/kg；阳性对照组 5 只，硫氮革酮 5mg/kg；愈心痛小剂量组 5 只，每公斤体重生药 1g；愈心痛大剂量组 5 只，每公斤体重生药 2g。

采用结扎麻醉犬冠脉左前降支中段的方式，复制心肌缺血病理模型，由心外膜电图监测心肌缺血情况，于结扎 15min 后，各组经十二指肠给予实验药物和生理盐水，结扎后 3h，迅速取下心脏，立即在犬左心室第三片标本上取缺血区与非缺血区心肌组织块 0.5cm×0.5cm×0.5cm 大小，液氮冻存，作 5~6um 厚连续冰冻切片。

2. 药品与试剂

愈心痛胶囊主要成分有红参、三七等，其提取干粉由吉林敖东制药厂提供；硫氮革酮由上海延安制药厂生产；地高辛-dUTP 标记试剂盒购自德国 Boehringer Mannheim 公司；ECE、NOS 基因探针由北京医科大学第三医院中心实验室惠赠，其片段长度分别为 1.1kb 和 660bp；铜锌-SOD 免疫组化试剂盒购自军事医学科学院。

3. 组织原位杂交

采用预杂交、杂交、显色反应三步法，以地高辛标记的 ECE 和 NOS 探针与心肌组织 mRNA 原位杂交，阳性杂交信号为深蓝色细颗粒状，位于胞浆内。

4. 免疫组化染色

采用 SP 法进行铜锌-SOD 免疫组化染色，抗原阳性信号为细胞浆内呈棕褐色颗粒。

5. 图像分析

用联有 NIKON 光学显微镜的 8502 型自动图像分析仪原位定量测量各组心肌组织的铜锌-SOD 阳性反应颗粒面积百分比和光密度值 (OD)。

研究结果

1. 愈心痛对 ECE mRNA 表达的影响

生理盐水组缺血心肌组织 ECE 呈高表达，细胞浆中可见大量细密蓝色颗粒；而愈心痛大剂量组仅见散在分布的杂交阳性颗粒；硫氮革酮组和愈心痛小剂量组缺血心肌细胞中可见 ECE mRNA 杂交信号，其表达量低于生理盐水组。

2. 愈心痛对 NOS mRNA 表达的影响

在非缺血区心肌细胞可见大量 NOS mRNA 表达的紫蓝色阳性反应颗粒分布于胞浆中；愈心痛大剂量组 NOS mRNA 蓝色阳性杂交颗粒密布于心肌胞浆内；硫氮革酮组和愈心痛小剂量组表达也较丰富；而生理盐水组缺血心肌中 NOS mRNA 表达量较少，且范围局限。

3. 愈心痛对铜锌-SOD 免疫组化反应的影响

光镜下可见，非缺血区心肌细胞阳性免疫反应颗粒呈深褐色，团块状，位于胞浆内；各用药组心肌细胞内也含有程度不等的深褐色抗原阳性反应颗粒，而生理盐水组缺血心肌细胞内阳性颗粒明显减少，且染色较浅。

4. 各组铜锌-SOD 免疫组化反应图像分析结果

生理盐水组缺血心肌组织铜锌-SOD 阳性颗粒面积百分比及光密度值均比非缺血区显著减少 (P<0.01)，而各用药组与非缺血区相比，也呈减少趋势，但比生理盐水组程度轻，组间差异明显 (P<0.05，P<0.01)。其阳性反应程度：愈心痛大剂量组 > 硫氮革酮组 > 愈心痛小剂量组。

讨论

内皮素 (ET) 是目前所知作用最强的内源性缩血管物质，它可引起冠状动脉强烈收缩，造成心肌缺血，甚至坏死。ECE 是 ET 生物合成过程中的关键酶。本研究发现，ECE mRNA 在缺血心肌细胞中呈高表达，提示 ECE mRNA 表达升高与心肌缺血有密切关系，而愈心痛和硫氮革酮均能削弱 ECE 基因在缺血心肌中的异常表达。

一氧化氮 (NO) 是一种作用强大的舒血管因子，NOS 是 NO 合成的关键酶。本研究表明，在缺血心肌中 NOS 表达减少或消失，而愈心痛胶囊和硫氮革酮均可提高缺血心肌 NOS mRNA 的表达水平，促进其转录合成，愈心痛大剂量组作用优于硫氮革酮组。

上述研究表明，在缺血心肌中，ECE 和 NOS mRNA 在基因表达水平上可能具有相互抑制作用，二者的平衡失调可能参与了心肌缺血性损伤的发生和发展过程，而愈心痛胶囊对 NOS 基因表达的促进作用和对 ECE 基因表达的抑制作用可能是其抗心肌缺血的主要机制之一。

近年来发现大量氧自由基生成及脂质过氧化反应是心肌缺血性损伤的主要机制之一。SOD 是氧自由基的特异性降解酶。本研究应用免疫组化技术及图像分析显示，心肌缺血时铜锌-SOD 明显减少，可能与缺血反应产生大量氧自由基而致铜锌-SOD 超量消耗有关。而愈心痛胶囊可以显著提高缺血心肌组织中铜锌-SOD 活性，该方中红参温阳益气，三七活血散瘀，据现代药理研究证明，红参中的麦芽醇和三七的主要化学成分三七总皂甙均有较强的抗氧化和增加 SOD 活性的作用。

本研究证实，愈心痛可通过影响 ECE mRNA 和 NOS mRNA 表达水平及抑制体内脂质过氧化反应而达到减轻心肌缺血损伤的作用，从而为愈心痛胶囊的临床应用提供进一步的理论依据。

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